Genetické obvody umožňují přesnější regulaci genové terapie

Mnoho nemocí je způsobeno chybějící nebo vadnou kopií jediného genu. Desítky let se vědci snaží vyvinout genové terapie, které by tyto nemoci vyléčily dodáním nové kopie chybějícího genu do postižených buněk.

Přes toto úsilí bylo Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) schváleno jen velmi málo genových terapií. Jednou z překážek vývoje těchto terapií je dosažení kontroly nad tím, kolik nového genu se v buňkách exprimuje – příliš málo a terapie nebude fungovat, příliš mnoho a může to způsobit vážné vedlejší účinky.

Aby pomohli dosáhnout přesnější kontroly genové terapie, inženýři z MIT vyladili a použili řídící obvod, který dokáže udržet hladiny exprese v cílovém rozmezí. Na lidských buňkách ukázali, že touto metodou mohou dodávat geny, které by mohly pomoci léčit nemoci, včetně syndromu X, poruchy vedoucí k mentální retardaci a dalším vývojovým problémům.

„Teoreticky dokáže doplnění genu řešit monogenní poruchy, které jsou velmi různorodé, ale mají relativně přímočarou genovou terapeutickou opravu, pokud by se terapie dala dostatečně kontrolovat,“ říká Katie Galloway, profesorka biomedicínského a chemického inženýrství a hlavní autorka nové studie.

Hlavní autorkou článku, který vyšel v časopise Cell Systems, je postgraduální studentka MIT Kasey Love. Mezi další autory patří postgraduální studenti MIT Christopher Johnstone, Emma Peterman a Stephanie Gaglione a Michael Birnbaum, docent biologického inženýrství na MIT.

Dodávání genů

Ačkoli genová terapie slibuje léčbu různých nemocí, včetně hemofilie a srpkovité anémie, dosud bylo schváleno jen několik terapií, a to pro dědičnou retinální chorobu a některé druhy rakoviny krve.

Většina přístupů k genové terapii využívá virus k dodání nové kopie genu, která se pak integruje do DNA hostitelských buněk. Některé buňky mohou přijmout mnoho kopií genu, zatímco jiné žádnou.

„Jednoduchá nadměrná exprese této zátěže může vést k velmi širokému rozmezí hladin exprese v cílových genech, jelikož přijímají různé počty kopií těchto genů nebo mají prostě různé hladiny exprese,“ říká Love. „Pokud se gen neexprimuje dostatečně, znehodnotí to účel terapie. Na druhou stranu, exprese na příliš vysoké úrovni je také problém, protože tato zátěž může být toxická.“

Aby se vědci pokusili tento problém překonat, experimentovali s různými typy řídících obvodů, které omezují expresi terapeutického genu. V této studii se tým z MIT rozhodl použít typ obvodu zvaný nekoherentní předběžná smyčka (IFFL).

V obvodu IFFL aktivace cílového genu současně aktivuje produkci molekuly, která potlačuje genovou expresi. Jedním typem molekuly, která se může použít k dosažení tohoto potlačení, je mikroRNA – krátká sekvence RNA, která se váže na messenger RNA a brání její translaci na protein.

V této studii navrhl tým z MIT obvod IFFL nazvaný „ComMAND“ (Kompaktní mikroRNA-zprostředkovaný tlumič šumu a dávky), takže vlákno mikroRNA, které potlačuje translaci mRNA, je zakódováno v rámci terapeutického genu. MikroRNA se nachází v krátké části zvané intron, která se z genu vyřízne, když se přepíše na mRNA. To znamená, že kdykoli se gen zapne, mRNA i mikroRNA, která ji potlačuje, se produkují přibližně ve stejném množství.

Tento přístup umožňuje výzkumníkům kontrolovat celý obvod ComMAND pouze jedním promotorem – místem DNA, kde se zapíná transkripce genu. Výměnou promotorů různé síly mohou výzkumníci upravit, kolik terapeutického genu se bude produkovat.

Kromě nabídky přísnější kontroly umožňuje kompaktní konstrukce obvodu jeho přenos na jediném nosiči, jako je lentivirus nebo adeno-asociovaný virus, což by mohlo zlepšit výrobu těchto terapií. Oba tyto viry se často používají k dodávání terapeutických nákladů.

„Jiní lidé vyvinuli mikroRNA založené nekoherentní předběžné smyčky, ale co Kasey udělala, je, že to všechno dala na jeden přepis, a ukázala, že to poskytuje nejlepší možnou kontrolu, když máte proměnlivou dodávku do buněk,“ říká Galloway.

Přesná kontrola

Aby tento systém demonstrovali, výzkumníci navrhli obvody ComMAND, které by mohly dodávat gen FXN, který je mutován u Friedreichovy ataxie – poruchy, která postihuje srdce a nervový systém. Dodali také gen Fmr1, jehož dysfunkce způsobuje syndrom X. V testech na lidských buňkách ukázali, že mohou vyladit hladiny genové exprese přibližně na osminásobek hladin běžně pozorovaných u zdravých buněk.

Bez ComMAND byla genová exprese více než 50krát vyšší než normální hladina, což by mohlo představovat bezpečnostní rizika. Výzkumníci říkají, že k určení optimálních hladin by byly zapotřebí další testy na zvířecích modelech.

Výzkumníci také provedli testy na neuronových buňkách potkanů, myších fibroblastech a lidských T buňkách. Do těchto buněk dodávali gen, který kóduje fluorescenční protein, takže mohli snadno měřit hladiny genové exprese. I v těchto buňkách výzkumníci zjistili, že mohou regulovat hladiny genové exprese přesněji než bez obvodu.

Výzkumníci nyní plánují zkoumat, zda by mohli tento přístup použít k dodávání genů na úrovni, která by obnovila normální funkci a zvrátila známky nemoci, ať už v kultivovaných buňkách nebo na zvířecích modelech.

„Pravděpodobně by bylo potřeba nějaké vyladění hladin exprese, ale rozumíme některým z těchto konstrukčních principů, takže kdybychom potřebovali hladiny vyladit nahoru nebo dolů, myslím, že bychom věděli, jak na to,“ říká Love.

Mezi další nemoci, na které by se tento přístup mohl použít, patří Rettův syndrom, svalová dystrofie a spinální svalová atrofie, říkají výzkumníci.

„Problém s mnoha z nich je, že jsou to také vzácné nemoci, takže nemáte velké populace pacientů,“ říká Galloway. „Snažíme se budovat tyto nástroje, které jsou robustní, aby lidé zjistili, jak provést ladění, protože populace pacientů jsou tak malé a není mnoho finančních prostředků na řešení některých z těchto poruch.“

Výzkum byl financován Národním institutem pro obecné lékařské vědy, Národní vědeckou nadací, Institutem pro kolaborativní biotechnologie a Výzkumnou laboratoří letectva.