Rychlé měření hustoty buněk odhaluje jejich zdravotní stav a vývoj

Měření hustoty buňky může odhalit mnoho o jejím stavu. Během buněčného růstu, diferenciace nebo apoptózy buňky získávají nebo ztrácejí vodu a další molekuly, což se projeví změnami hustoty.

Sledování těchto drobných změn ve fyzickém stavu buněk ve velkém měřítku, zejména s rozlišením jednotlivých buněk, je obtížné. Tým výzkumníků z MIT však nyní našel způsob, jak měřit hustotu buněk rychle a přesně – až 30 000 buněk za hodinu.

Výzkumníci také ukázali, že změny hustoty lze využít k cenným předpovědím, včetně toho, zda se imunitní buňky, jako jsou T buňky, aktivovaly k usmrcení nádorů, nebo zda jsou nádorové buňky citlivé na specifický lék.

„Tyto předpovědi jsou založeny na sledování velmi malých změn fyzikálních vlastností buněk, které mohou napovědět, jak budou reagovat,“ říká Scott Manalis, profesor inženýrství na MIT.

Manalis je hlavním autorem nové studie, která vyšla v časopise Nature Biomedical Engineering. Hlavním autorem článku je Weida (Richard) Wu.

Měření hustoty

Jak buňky vstupují do nových stavů, jejich molekulární obsah, včetně lipidů, proteinů a nukleových kyselin, se může více či méně zhušťovat. Měření hustoty buňky nabízí nepřímý pohled na toto zhušťování.

Nová technika měření hustoty popsaná v této studii vychází z práce, kterou Manalisova laboratoř prováděla v posledních dvou desetiletích na technologiích pro měření buněk a drobných částic. V roce 2007 jeho laboratoř vyvinula mikrofluidní zařízení známé jako suspenzní mikrokanálový rezonátor (SMR), který se skládá z mikrokanálu přes malý křemíkový nosník, který vibruje na specifické frekvenci. Jak buňka prochází kanálem, frekvence vibrací se mírně změní a velikost této změny lze použít k výpočtu hmotnosti buňky.

V roce 2011 výzkumníci tuto techniku přizpůsobili k měření hustoty buněk. K tomu se buňky posílají zařízením dvakrát, suspendované ve dvou kapalinách s různou hustotou. Vztlaková hmotnost buňky (její hmotnost, když plave v kapalině) závisí na její absolutní hmotnosti a objemu, takže měřením dvou různých vztlakových hmotností buňky lze vypočítat její hmotnost, objem a hustotu.

Tato technika funguje dobře, ale výměna kapalin a proudění buněk každým z nich je časově náročné, takže se dá použít pouze k měření několika stovek buněk najednou.

Aby vytvořili rychlejší a efektivnější systém, výzkumníci zkombinovali své zařízení SMR s fluorescenčním mikroskopem, který umožňuje měření objemu buněk. Mikroskop je umístěn u vchodu do rezonátoru a buňky protékají zařízením, zatímco plavou v fluorescenční barvě, kterou buňky nemohou absorbovat. Když buňky projdou kolem mikroskopu, pokles fluorescenčního signálu lze použít k určení objemu buňky.

Poté, co se provede měření objemu, buňky proudí do rezonátoru, který měří jejich hmotnost. Tento proces, který umožňuje rychlý výpočet hustoty, lze použít k měření až 30 000 buněk za hodinu.

„Místo toho, abychom se snažili nechat buňky proudit tam a zpět alespoň dvakrát přes nosník, abychom získali hustotu buňky, chtěli jsme vytvořit metodu, která by umožnila zjednodušené měření, takže buňky musí projít nosníkem pouze jednou,“ říká Wu. „Z hmotnosti a objemu buňky pak můžeme odvodit její hustotu bez kompromisu propustnosti nebo přesnosti.“

Hodnocení T buněk

Výzkumníci použili svou novou techniku ke sledování toho, co se děje s hustotou T buněk po jejich aktivaci signálními molekulami.

Jak T buňky přecházejí z klidového stavu do aktivního stavu, získávají nové molekuly i vodu, zjistili výzkumníci. Od pre-aktivačního stavu do prvního dne aktivace klesla hustota buněk z průměru 1,08 gramu na mililitr na 1,06 gramu na mililitr. To znamená, že buňky se stávají méně zhuštěné, protože získávají vodu rychleji než jiné molekuly.

„To naznačuje, že hustota buněk velmi pravděpodobně odráží zvýšení obsahu buněčné vody, když buňky přecházejí z klidového, neproliferačního stavu do stavu vysokého růstu,“ říká Wu. „Tyto údaje poukazují na to, že hustota buněk je zajímavý biomarker, který se mění během aktivace T buněk a může mít funkční relevanci pro to, jak dobře se T buňky mohou množit.“

Společnost Travera, klinická společnost spoluzaložená Manalisem, pracuje na použití měření hmotnosti SMR k předpovědi, zda T buňky jednotlivých pacientů s rakovinou budou reagovat na léky určené ke stimulaci silné protinádorové imunitní odpovědi. Společnost také začala používat techniku měření hustoty a předběžné studie zjistily, že použití měření hmotnosti a hustoty společně poskytuje mnohem přesnější předpověď než použití pouze jednoho z nich.

„Jak hmotnost, tak hustota odhalují něco o celkové kondici imunitních buněk,“ říká Manalis.

Použití fyzikálních měření buněk ke sledování jejich imunitní aktivace „je velmi vzrušující a může nabídnout nový způsob hodnocení a měření změn imunitních buněk v oběhu,“ říká Genevieve Boland, profesorka chirurgie na Harvard Medical School.

„Toto je doplňková, ale velmi odlišná metoda než ty, které se v současnosti používají pro imunologické posouzení u rakoviny a dalších nemocí, a potenciálně nabízí nový nástroj pro pomoc při klinickém rozhodování ohledně potřeby a volby specifické protinádorové terapie, umožňuje monitorování reakce na terapii a/nebo včasné odhalování vedlejších účinků imunoterapie,“ říká.

Predikce

Další potenciální aplikací tohoto přístupu je předpovídání, jak budou nádorové buňky reagovat na různé typy léků proti rakovině. V předchozí práci Manalis ukázal, že sledování změn v buněčné hmotě po léčbě může předpovědět, zda nádorová buňka prochází lékem indukovanou apoptózou. V nové studii zjistil, že hustota může tyto reakce také odhalit.

V těchto experimentech výzkumníci léčili buňky rakoviny pankreatu jedním ze dvou různých léků – jedním, na který jsou buňky citlivé, a jedním, na který jsou rezistentní. Zjistili, že změny hustoty po léčbě přesně odrážely známé reakce buněk na léčbu.

„Zachytáváme něco o buňkách, co je vysoce prediktivní během prvních pár dnů poté, co jsou odebrány z nádoru,“ říká Wu. „Hustota buněk je rychlý biomarker pro předpověď in vivo odpovědi na léky včasným způsobem.“

Manalisova laboratoř nyní pracuje na použití měření buněčné hmotnosti a hustoty jako způsob hodnocení kondice buněk používaných k syntéze komplexních proteinů, jako jsou terapeutické protilátky.

„Jak buňky produkují tyto proteiny, můžeme se z těchto markerů buněčné kondice a metabolického stavu naučit předvídat, jak dobře tyto buňky mohou tyto proteiny produkovat, a doufejme, že v budoucnu také řídit návrhové a řídicí strategie, aby se dále zlepšila výtěžnost těchto komplexních proteinů,“ říká Wu.

Výzkum byl financován skupinou Paul G. Allen Frontiers Group, fondem Virginia and Daniel K. Ludwig Fund for Cancer Research, Centrem MIT pro precizní onkologii, programem Stand up to Cancer Convergence Program, společností Bristol Myers Squibb a grantem Koch Institute Support (core) od Národního institutu pro rakovinu.