Nová molekulární značka by mohla vést k jednodušším a rychlejším testům na tuberkulózu

Tuberkulóza, nejnebezpečnější infekční onemocnění na světě, ročně infikuje odhadem 10 milionů lidí a způsobí více než 1 milion úmrtí. Jakmile se bakterie usídlí v plicích, její tlustá buněčná stěna jí pomáhá bránit se imunitnímu systému hostitele.

Většina této buněčné stěny je tvořena komplexními molekulami cukru, známými jako glykany, ale není dobře pochopeno, jak tyto glykany pomáhají bakteriím se bránit. Jedním z důvodů je, že neexistoval snadný způsob, jak je označit uvnitř buněk.

Chemici z MIT nyní tuto překážku překonali a prokázali, že mohou označit glykan zvaný ManLAM pomocí organické molekuly, která reaguje se specifickými sirnými cukry. Tyto cukry se nacházejí pouze ve třech bakteriálních druzích, z nichž nejznámější a nejrozšířenější je Mycobacterium tuberculosis, mikroorganismus, který způsobuje TBC.

Po označení glykanu byli výzkumníci schopni vizualizovat jeho polohu v bakteriální buněčné stěně a studovat, co se s ním děje během prvních několika dnů infekce tuberkulózy imunitních buněk hostitele.

Výzkumníci nyní doufají, že tento přístup využijí k vývoji diagnostického nástroje, který by dokázal detekovat glykany spojené s TBC, ať už v kultuře nebo v vzorku moči, což by mohlo nabídnout levnější a rychlejší alternativu k existujícím diagnostickým metodám. Rentgenové snímky hrudníku a molekulární diagnostika jsou velmi přesné, ale nejsou vždy dostupné v rozvojových zemích, kde je výskyt TBC vysoký. V těchto zemích se TBC často diagnostikuje kultivací mikrobů ze vzorku sputa, ale tento test má vysokou míru falešně negativních výsledků a může být pro některé pacienty, zvláště pro děti, obtížné poskytnout vzorek sputa. Tento test také vyžaduje několik týdnů, než bakterie vyrostou, což zpomaluje diagnostiku.

„Neexistuje mnoho dobrých diagnostických možností a existují některé skupiny pacientů, včetně dětí, které mají problémy s poskytnutím vzorků, které lze analyzovat. Existuje velký tlak na vývoj velmi jednoduchých a rychlých testů,“ říká Laura Kiesslingová, profesorka chemie na MIT a hlavní autorka studie.

Hlavní autorkou článku, který vyšel tento týden v časopise Proceedings of the National Academy of Sciences, je postgraduální studentka MIT Stephanie Smelyanská. Mezi další autory patří Chi-Wang Ma, postdoktorand MIT; Victoria Marando PhD '23; Gregory Babunovic, postdoktorand na Harvard T.H. Chan School of Public Health; So Young Lee, postgraduální studentka MIT; a Bryan Bryson, docent biologického inženýrství na MIT.

Označování glykanů

Glykany se nacházejí na povrchu většiny buněk, kde plní kritické funkce, jako je zprostředkování komunikace mezi buňkami. U bakterií glykany pomáhají mikrobům vstupovat do hostitelských buněk a také se zdají komunikovat s imunitním systémem hostitele, v některých případech blokují imunitní odpověď.

„Mycobacterium tuberculosis má ve srovnání s jinými bakteriemi opravdu propracovanou buněčnou obálku a je to bohatá struktura, která se skládá z mnoha různých glykanů,“ říká Smelyanská. „Něco, co se často podceňuje, je skutečnost, že tyto glykany mohou také interagovat s našimi hostitelskými buňkami. Když naše imunitní buňky rozpoznají tyto glykany, místo aby vysílaly signál nebezpečí, mohou vyslat opačný signál, že nebezpečí nehrozí.“

Glykany jsou notoricky obtížně označitelné jakýmkoli typem sondy, protože na rozdíl od proteinů nebo DNA nemají charakteristické sekvence nebo chemické reaktivity, které by bylo možné cílit. A na rozdíl od proteinů nejsou geneticky kódovány, takže buňky nelze geneticky upravovat tak, aby produkovaly cukry označené fluorescenčními značkami, jako je zelený fluorescenční protein.

Jeden z klíčových glykanů v M. tuberculosis, známý jako ManLAM, obsahuje vzácný cukr známý jako MTX, který je neobvyklý v tom, že má thioether – atom síry sevřený mezi dvěma atomy uhlíku. Tato chemická skupina představovala příležitost použít značku malé molekuly, která byla dříve vyvinuta pro označování methioninu, aminokyseliny, která obsahuje podobnou skupinu.

Výzkumníci ukázali, že mohou použít tuto značku, známou jako oxaziridin, k označení ManLAM v M. tuberculosis. Výzkumníci spojili oxaziridin s fluorescenční sondou a ukázali, že v M. tuberculosis se tato značka objevila ve vnější vrstvě buněčné stěny. Když výzkumníci vystavovali značku Mycobacterium smegmatis, příbuzné bakterii, která nezpůsobuje onemocnění a nemá cukr MTX, neviděli žádný fluorescenční signál.

„Toto je první přístup, který nám skutečně selektivně umožňuje vizualizovat jeden glykan,“ říká Smelyanská.

Lepší diagnostika

Výzkumníci také ukázali, že po označení ManLAM v buňkách M. tuberculosis mohli sledovat buňky, jak infikují imunitní buňky zvané makrofágy. Někteří výzkumníci tuberkulózy předpokládali, že bakteriální buňky po vstoupení do hostitelské buňky uvolňují ManLAM a že tyto volné glykany poté interagují s imunitním systémem hostitele. Tým z MIT však zjistil, že glykan zůstává v bakteriálních buněčných stěnách alespoň během prvních několika dnů infekce.

„Bakterie stále mají své buněčné stěny připojené. Takže je možné, že se nějaká část glykanu uvolňuje, ale většina z něj se udržuje na bakteriálním buněčném povrchu, což nikdy předtím nebylo ukázáno,“ říká Smelyanská.

Výzkumníci nyní plánují použít tento přístup ke studiu toho, co se stane s bakteriemi po léčbě různými antibiotiky nebo stimulaci imunity makrofágů. Mohlo by se to také použít k podrobnějšímu studiu toho, jak se sestavuje bakteriální buněčná stěna a jak ManLAM pomáhá bakteriím dostat se do makrofágů a jiných buněk.

„Mít možnost sledovat bakterie je velmi cenné a umožní vám vizualizovat procesy, jak v buňkách, tak v modelech zvířat, které byly dříve neviditelné,“ říká Kiesslingová.

Doufá také, že tento přístup využije k vytvoření nové diagnostiky tuberkulózy. V současné době se vyvíjí diagnostika, která používá protilátky k detekci ManLAM ve vzorku moči. Tento test však funguje dobře pouze u pacientů s velmi aktivními případy TBC, zejména u lidí, kteří jsou imunodeprimovaní kvůli HIV nebo jiným stavům.

Pomocí svého senzoru malých molekul místo protilátek doufá tým z MIT, že vyvine citlivější test, který by dokázal detekovat ManLAM v moči i při přítomnosti malého množství.

„Toto je krásně elegantní přístup k selektivnímu označení povrchu mykobakterií, který umožňuje sledování dynamiky buněčných stěn v této důležité bakteriální rodině v reálném čase. Takové zkoumání bude informovat o vývoji nových strategií pro diagnostiku, prevenci a léčbu mykobakteriálních onemocnění, zejména tuberkulózy, která zůstává globálním zdravotním problémem,“ říká Todd Lowary, významný výzkumný pracovník v Institutu biologické chemie, Academia Sinica, Tchaj-pej, Tchaj-wan, který se na výzkumu nepodílel.

Výzkum byl financován Národním institutem pro alergie a infekční choroby, Národními instituty zdraví, Národní vědeckou nadací a Croucherovým stipendiem.