Nová metoda kombinuje zobrazování a sekvenování pro studium funkce genů v intaktní tkáni

Představte si, že chcete znát děj filmu, ale máte přístup pouze k obrazu nebo zvuku. Pouze s obrazem vám unikne veškerý dialog. Jen se zvukem vám unikne děj. Pochopení naší biologie může být podobné. Měření jednoho typu dat – například toho, které geny se exprimují – může být informativní, ale zachycuje pouze jednu stránku mnohostranného příběhu. U mnoha biologických procesů a mechanismů nemocí nelze celý „děj“ plně pochopit bez kombinování typů dat.

Nicméně zachycení jak „obrazu“, tak „zvuku“ biologických dat, jako jsou data o expresi genů a struktuře buněk, ze stejných buněk vyžaduje od vědců vývoj nových přístupů. Také musí zajistit, aby data, která zachycují, přesně odrážela to, co se děje v živých organismech, včetně toho, jak buňky interagují navzájem a s jejich prostředím.

Vědci z Whitehead Institute for Biomedical Research a Harvard University se chopili těchto výzev a vyvinuli Perturb-Multimodal (Perturb-Multi), výkonný nový přístup, který současně měří, jak genetické změny, jako je vypnutí jednotlivých genů, ovlivňují jak expresi genů, tak strukturu buněk v intaktní tkáni jater. Metoda, popsaná v časopise Cell 12. června, si klade za cíl urychlit objevování toho, jak geny řídí funkci orgánů a nemoci.

Výzkumný tým vedený členem Whitehead Institute Jonathanem Weissmanem a tehdejším postgraduálním studentem v jeho laboratoři Reubenem Sandersem, spolu s Xiaowei Zhuang, profesorem věd na Harvardově univerzitě, a tehdejším postdokem v její laboratoři Willem Allenem, vytvořil systém, který dokáže testovat stovky různých genetických modifikací v jediných myších játrech, přičemž zachycuje více typů dat ze stejných buněk.

„Pochopení toho, jak naše orgány fungují, vyžaduje současný pohled na mnoho různých aspektů buněčné biologie,“ říká Saunders. „S Perturb-Multi můžeme sledovat, jak vypnutí specifických genů mění nejen to, které další geny jsou aktivní, ale také to, jak jsou proteiny distribuovány v buňkách, jak jsou organizovány buněčné struktury a kde se buňky nacházejí v tkáni. Je to jako mít více specializovaných mikroskopů, které se všechny zaměřují na stejný experiment.“

„Tento přístup urychluje objevování tím, že nám umožňuje testovat funkce mnoha různých genů najednou a poté pro každý gen měřit mnoho různých funkčních výstupů nebo buněčných vlastností najednou – a to děláme v intaktní tkáni ze zvířat,“ říká Zhuang, která je také vyšetřovatelkou Howard Hughes Medical Institute (HHMI).

Účinější přístup ke genetickým studiím

Tradiční genetické studie u myší často vypínají jeden gen a poté sledují, jaké změny nastanou v nepřítomnosti tohoto genu, aby se dozvěděly, co gen dělá. Vědci navrhli svůj přístup k vypnutí stovek různých genů v jedněch játrech, přičemž stále vypínají pouze jeden gen na buňku – pomocí tzv. mozaikového přístupu. To jim umožnilo studovat role stovek jednotlivých genů najednou u jediného jedince. Vědci poté shromáždili rozmanité typy dat z buněk napříč stejnými játry, aby získali ucelený obraz o důsledcích vypnutí genů.

„Každá buňka slouží jako svůj vlastní experiment a protože všechny buňky jsou ve stejném zvířeti, eliminujeme variabilitu, která pochází ze srovnávání různých myší,“ říká Saunders. „Každá buňka zažívá stejné fyziologické podmínky, stravu a prostředí, což činí naše srovnání mnohem přesnějšími.“

„Výzvou, které jsme čelili, bylo, že tkáně, aby plnily své funkce, se spoléhají na tisíce genů, které se exprimují v mnoha různých buňkách a pracují společně. Každý gen zase může řídit mnoho aspektů funkce buňky. Testování těchto stovek genů u myší pomocí současných metod by bylo extrémně pomalé a drahé – v praxi téměř nemožné,“ říká Allen.

Odhalování nové biologie prostřednictvím kombinovaných měření

Tým aplikoval Perturb-Multi ke studiu genetických kontrol fyziologie a funkce jater. Jejich studie vedla k objevům ve třech důležitých aspektech biologie jater: akumulaci tuků v jaterních buňkách – prekurzoru jaterního onemocnění; stresových reakcí; a zonaci hepatocytů (jak se jaterní buňky specializují, předpokládají si různé vlastnosti a funkce v závislosti na své poloze v játrech).

Jeden pozoruhodný nález vzešel ze studia genů, které, když jsou narušeny, způsobují akumulaci tuků v jaterních buňkách. Zobrazovací data ukázala, že čtyři různé geny vedly k podobné akumulaci tukových kapiček, ale data sekvenování ukázala, že to dělají třemi zcela odlišnými mechanismy.

„Bez kombinování zobrazování a sekvenování bychom tuto komplexnost zcela přehlédli,“ říká Saunders. „Zobrazování nám řeklo, které geny ovlivňují akumulaci tuků, zatímco sekvenování odhalilo, zda je to způsobeno zvýšenou produkcí tuků, buněčným stresem nebo jinými cestami. Tento druh mechanistického poznání by mohl být rozhodující pro vývoj cílených terapií pro onemocnění tučných jater.“

Vědci také objevili nové regulátory zonace jaterních buněk. Neočekávaně mezi nově objevené regulátory patří geny zapojené do modifikace extracelulární matrix – lešení mezi buňkami. „Zjistili jsme, že buňky mohou měnit své specializované funkce bez fyzického přesunu do jiné zóny,“ říká Saunders. „To naznačuje, že identita jaterních buněk je flexibilnější, než se dříve myslelo.“

Technologická inovace umožňuje novou vědu

Vývoj Perturb-Multi vyžadoval řešení několika technických problémů. Tým vytvořil nové metody pro zachování obsahu zájmu v buňkách – RNA a proteinů – během zpracování tkáně, pro sběr mnoha typů zobrazovacích dat a dat o expresi genů z jednotlivých buněk z tkáňových vzorků, které byly fixovány konzervantem, a pro integraci více typů dat ze stejných buněk.

„Překonání inherentní složitosti biologie u živých zvířat vyžadovalo vývoj nových nástrojů, které propojují více oborů – v tomto případě genomiku, zobrazování a AI,“ říká Allen.

Dvě složky Perturb-Multi – zobrazovací a sekvenační testy – společně aplikované na stejnou tkáň, poskytují poznatky, které jsou nedosažitelné pomocí kteréhokoli testu samostatně.

„Každá součást musela fungovat perfektně, aniž by rušila ostatní,“ říká Weissman, který je také profesorem biologie na MIT a vyšetřovatelem HHMI. „Technologický vývoj vyžadoval značné úsilí, ale odměnou je systém, který dokáže odhalit biologii, kterou jsme prostě nemohli vidět dříve.“

Rozšiřování na nové orgány a další kontexty

Vědci plánují rozšířit Perturb-Multi na další orgány, včetně mozku, a studovat, jak genetické změny ovlivňují funkci orgánů za různých podmínek, jako jsou stavy onemocnění nebo změny stravy.

„Také se těšíme na použití dat, která generujeme, k trénování modelů strojového učení,“ dodává Saunders. „S dostatečným počtem příkladů toho, jak genetické změny ovlivňují buňky, bychom nakonec mohli předvídat účinky mutací bez nutnosti jejich experimentálního testování – „virtuální buňka“, která by mohla urychlit jak výzkum, tak vývoj léků.“

„Perturbační data jsou kritická pro trénování takových modelů AI a nedostatek existujících perturbačních dat představuje hlavní překážku v takových snahách o „virtuální buňky“,“ říká Zhuang. „Doufáme, že Perturb-Multi tuto mezeru zaplní urychlením sběru perturbačních dat.“

Přístup je navržen tak, aby byl škálovatelný, s potenciálem pro genomové studie, které testují tisíce genů současně. Jak se technologie sekvenování a zobrazování neustále zlepšují, vědci očekávají, že Perturb-Multi se stane ještě silnějším a přístupnějším pro širší vědeckou komunitu.

„Naším cílem je neustálé zvyšování měřítka. Plánujeme provádět genomové perturbace, studovat různé fyziologické podmínky a zkoumat různé orgány,“ říká Weissman. „To, že nyní můžeme shromažďovat tolik typů dat z tolika buněk tak rychle, bude klíčové pro budování modelů AI jako jsou virtuální buňky, a myslím si, že nám to pomůže odpovědět na dříve neřešitelné otázky týkající se zdraví a nemocí.“