MIT vyvinula metodu pro ultrarychlé značení proteinů v milionech buněk

Vědci z MIT vyvinuli novou technologii, která umožňuje značení proteinů v milionech jednotlivých buněk v neporušených 3D tkáních s bezprecedentní rychlostí, uniformitou a všestranností. Tým dokázal pomocí této technologie bohatě označit velké vzorky tkání během jediného dne. V nové studii v časopise Nature Biotechnology také demonstrují, že schopnost značit proteiny protilátkami na úrovni jednotlivých buněk v rozsáhlých vzorcích tkání může odhalit poznatky, které zůstávají skryty před jinými běžně používanými metodami značení.

Profilování proteinů, které buňky produkují, je základem studií v biologii, neurovědách a souvisejících oborech, protože proteiny, které buňka v daném okamžiku exprimuje, mohou odrážet funkce, které se buňka snaží plnit, nebo její reakci na okolnosti, jako je nemoc nebo léčba. Navzdory pokroku v mikroskopii a technologiích značení, které umožnily nesčetné objevy, vědcům stále chyběl spolehlivý a praktický způsob sledování exprese proteinů na úrovni milionů hustě uspořádaných jednotlivých buněk v celých, neporušených 3D tkáních. Vědci byli často omezeni na tenké řezy tkání pod sklíčky, a proto neměli nástroje k důkladnému pochopení exprese buněčných proteinů v celých, propojených systémech, ve kterých k ní dochází.

„Konvenčně vyžaduje zkoumání molekul v buňkách disociaci tkáně na jednotlivé buňky nebo její krájení na tenké řezy, protože světlo a chemikálie potřebné pro analýzu nemohou proniknout hluboko do tkání. Naše laboratoř vyvinula technologie, jako je CLARITY a SHIELD, které umožňují zkoumání celých orgánů jejich zprůhledněním, ale nyní jsme potřebovali způsob, jak chemicky označit celé orgány, abychom získali užitečné vědecké poznatky,“ říká hlavní autor studie Kwanghun Chung, docent na Picowerově institutu pro učení a paměť, na katedrách chemického inženýrství a neurověd a kognitivních věd a na Institutu pro lékařské inženýrství a vědu na MIT. „Pokud nejsou buňky v tkáni rovnoměrně zpracovány, nelze je kvantitativně porovnávat. Při konvenčním značení proteinů může difúze těchto molekul do neporušených orgánů trvat týdny, což činí rovnoměrné chemické zpracování tkání v měřítku orgánů prakticky nemožným a extrémně pomalým.“

Nový přístup nazvaný „CuRVE“ představuje významný pokrok – na kterém se pracovalo několik let – směrem k tomuto cíli tím, že demonstruje zásadně nový přístup k rovnoměrnému zpracování velkých a hustých tkání jako celku. Ve studii výzkumníci vysvětlují, jak překonali technické překážky prostřednictvím implementace CuRVE nazvané „eFLASH“, a poskytují bohaté názorné ukázky technologie, včetně toho, jak přinesla nové poznatky v neurovědách.

„Toto je významný skok, zejména pokud jde o skutečný výkon technologie,“ říká spoluautor Dae Hee Yun, PhD '24, nedávný absolvent MIT, který je nyní vedoucím aplikačním inženýrem ve společnosti LifeCanvas Technologies, startupu, který Chung založil k šíření nástrojů, které jeho laboratoř vynalezla. Dalším hlavním autorem článku je Young-Gyun Park, bývalý postdoktorand MIT, který je nyní asistentem profesora na KAIST v Jižní Koreji.

Chytrá chemie

Základním důvodem, proč je obtížné rovnoměrně značit velké 3D vzorky tkání, je to, že protilátky se do tkáně prosakují velmi pomalu, ale rychle se váží na cílové proteiny. Praktickým důsledkem této neshody rychlosti je, že prosté namočení mozku do lázně protilátek bude znamenat, že proteiny budou intenzivně označeny na vnější hraně tkáně, ale prakticky žádné protilátky nenajdou buňky a proteiny hlouběji uvnitř.

Pro zlepšení značení tým vymyslel způsob – koncepční podstatu CuRVE – jak vyřešit nesoulad rychlosti. Strategií bylo kontinuálně řídit tempo vazby protilátek a zároveň urychlit permeaci protilátek celou tkání. Aby zjistili, jak by to mohlo fungovat a optimalizovali přístup, vytvořili a spustili sofistikovanou počítačovou simulaci, která jim umožnila testovat různá nastavení a parametry, včetně různých rychlostí vazby a hustoty a složení tkání.

Poté se pustili do implementace svého přístupu ve skutečných tkáních. Jejich výchozím bodem byla předchozí technologie nazvaná „SWITCH“, ve které Chungova laboratoř vymyslela způsob, jak dočasně vypnout vazbu protilátek, nechat protilátky pronikat tkání a poté vazbu znovu zapnout. I když to fungovalo dobře, tým si uvědomil, že by mohlo dojít k podstatnému zlepšení, pokud by se rychlost vazby protilátek dala neustále řídit, ale chemikálie použité v SWITCH byly příliš drsné pro takovou kontinuální léčbu. Tým proto prověřil knihovnu podobných chemikálií, aby našel takovou, která by mohla jemněji a kontinuálněji regulovat rychlost vazby protilátek. Zjistili, že deoxycholová kyselina je ideální kandidát. Pomocí této chemikálie mohl tým nejen modulovat vazbu protilátek změnou koncentrace chemikálie, ale také změnou pH (nebo kyselosti) označovací lázně.

Mezitím pro zrychlení pohybu protilátek tkáněmi tým použil další předchozí technologii vynalezenou v Chungově laboratoři: stochastický elektrotransport. Tato technologie urychluje disperzi protilátek tkání aplikací elektrických polí.

Implementace tohoto systému eFLASH s urychlenou disperzí a kontinuálně modifikovatelnou rychlostí vazby vedla k široké škále úspěchů při značení, které jsou demonstrovány v článku. Celkem tým uvedl použití více než 60 různých protilátek k značení proteinů v buňkách v rozsáhlých vzorcích tkání.

Je pozoruhodné, že každý z těchto vzorků byl označen během jednoho dne, což je podle autorů „ultrarychlá“ rychlost pro celé, neporušené orgány. Navíc různé přípravy nevyžadovaly nové optimalizační kroky.

Cenné vizualizace

Mezi způsoby, jakými tým otestoval eFLASH, patřilo srovnání jejich značení s jinou často používanou metodou: genetickým inženýrstvím buněk, aby fluoreskovaly, když se přepíše gen pro protein zájmu. Genetická metoda nevyžaduje disperzi protilátek tkání, ale může být náchylná k nesrovnalostem, protože hlášení transkripce genů a skutečná produkce proteinů nejsou přesně to samé. Yun dodal, že zatímco značení protilátkami spolehlivě a okamžitě informuje o přítomnosti cílového proteinu, genetická metoda může být mnohem méně okamžitá a trvalá, stále fluoreskuje i když skutečný protein již není přítomen.

Ve studii tým současně použil oba druhy značení ve vzorcích. Vizualizací štítků tímto způsobem viděli mnoho příkladů, ve kterých se značení protilátkami a genetické značení výrazně lišily. V některých oblastech myších mozků zjistili, že dvě třetiny neuronů exprimujících PV (protein prominentní v určitých inhibičních neuronech) podle značení protilátkami nevykazovaly žádnou geneticky podmíněnou fluorescenci. V dalším příkladu pouze nepatrná část buněk, které hlásily expresi prostřednictvím genetické metody proteinu zvaného ChAT, ji také hlásily prostřednictvím značení protilátkami. Jinými slovy, existovaly případy, kdy genetické značení značně podhodnocovalo nebo nadhodnocovalo expresi proteinů ve srovnání se značením protilátkami.

Výzkumníci tím nechtějí zpochybňovat jasnou hodnotu používání genetických metod hlášení, ale místo toho naznačují, že použití značení protilátek v celém orgánu, jak umožňuje eFLASH, může pomoci umístit tato data do bohatšího, úplnějšího kontextu. „Náš objev rozsáhlé regionalizované ztráty PV-imunoreaktivních neuronů u zdravých dospělých myší a s vysokou individuální variabilitou zdůrazňuje význam holistického a nezaujatého fenotypingu,“ píší autoři.

Nebo jak říká Yun, dva různé druhy značení jsou „dva různé nástroje pro danou práci“.

Kromě Yuna, Parka a Chunga jsou dalšími autory článku Jae Hun Cho, Lee Kamentsky, Nicholas Evans, Nicholas DiNapoli, Katherine Xie, Seo Woo Choi, Alexandre Albanese, Yuxuan Tian, Chang Ho Sohn, Qiangge Zhang, Minyoung Kim, Justin Swaney, Webster Guan, Juhyuk Park, Gabi Drummond, Heejin Choi, Luzdary Ruelas a Guoping Feng.

Financování studie pocházelo od Burroughs Wellcome Fund, Searle Scholars Program, Packard Award in Science and Engineering, NARSAD Young Investigator Award, McKnight Foundation, Freedom Together Foundation, The Picower Institute for Learning and Memory, NCSOFT Cultural Foundation a National Institutes of Health.