Stručná historie expanzní mikroskopie

Před téměř 150 lety si vědci začali představovat, jak informace proudí mozkem na základě tvarů neuronů, které viděli pod tehdejšími mikroskopy. S dnešními zobrazovacími technologiemi se vědci mohou přiblížit mnohem podrobněji, vidět drobné synapse, jimiž neurony komunikují navzájem, a dokonce i molekuly, které buňky používají k předávání svých zpráv. Tyto podrobné pohledy mohou vést k novým nápadům o fungování zdravého mozku a odhalit důležité změny, které přispívají k nemocem.

Tento ostřejší pohled na biologii není jen o pokroku, který učinil mikroskopy silnějšími než kdy předtím. Pomocí metodiky vyvinuté v laboratoři Edwarda Boydena, badatele MIT McGovern Institute for Brain Research, zobrazují výzkumníci po celém světě vzorky, které byly zvětšeny až na 20násobek své původní velikosti, aby jejich nejjemnější rysy byly lépe viditelné.

„Je to velmi odlišný způsob mikroskopie,“ říká Boyden, který je také výzkumníkem Howard Hughes Medical Institute (HHMI), profesorem mozkových a kognitivních věd a biologického inženýrství a členem Yang Tan Collective na MIT. „Na rozdíl od posledních 300 let biozobrazování, kdy se k zvětšení obrazu světla z objektu používá čočka, fyzicky zvětšujeme samotné objekty.“ Jakmile je tkáň rozšířena, říká Boyden, výzkumníci mohou vidět více i s běžně dostupným, konvenčním mikroskopickým hardwarem.

Boydenův tým představil tento přístup, který pojmenovali expanzní mikroskopie (ExM), v roce 2015. Od té doby metodu zdokonalují a rozšiřují její možnosti, zatímco výzkumníci na MIT i jinde ji nasazují k poznávání života v nejmenším měřítku.

„Šíří se velmi rychle v biologii a medicíně,“ říká Boyden. „Používá se při studiu onemocnění ledvin, mozku octomilek, rostlinných semen, mikrobiomu, Alzheimerovy choroby, virů a mnoha dalších věcí.“

Počátky ExM

K vývoji expanzní mikroskopie se Boyden a jeho tým obrátili k hydrogelu, materiálu s pozoruhodnými absorpčními vlastnostmi vody, který byl již prakticky využíván; je vrstven uvnitř jednorázových plen, aby udržoval miminka v suchu. Boydenova laboratoř vyslovila hypotézu, že hydrogely si zachovají svou strukturu, zatímco absorbují stovky násobků své původní hmotnosti ve vodě, čímž rozšiřují prostor mezi svými chemickými komponentami, jak bobtnají.

Po několika experimentech Boydenův tým určil čtyři klíčové kroky k zvětšení vzorků tkání pro lepší zobrazování. Za prvé, tkáň musí být infuzována hydrogelu. Komponenty tkáně, biomolekuly, jsou ukotveny k síťovité matrici gelu, která je přímo spojuje s molekulami tvořícími gel. Poté je tkáň chemicky změkčena a přidá se voda. Jak hydrogel absorbuje vodu, bobtná a tkáň se rozpíná, roste rovnoměrně, takže relativní polohy jejích komponent jsou zachovány.

První zpráva Boydena a doktorandů Fei Chena a Paula Tillberga o expanzní mikroskopii byla publikována v časopise Science v roce 2015. V ní tým ukázal, že roztažením molekul, které byly uvnitř buněk stísněny, se rysy, které by se pod standardním světelným mikroskopem rozmazaly, staly oddělenými a zřetelnými. Světelné mikroskopy mohou rozlišovat mezi objekty, které jsou od sebe vzdáleny asi 300 nanometrů – limit daný zákony fyziky. S expanzní mikroskopií Boydenova skupina ohlásila efektivní rozlišení asi 70 nanometrů při čtyřnásobném zvětšení.

Boyden říká, že je to úroveň jasnosti, kterou biologové potřebují. „Biologie je v zásadě v konečném důsledku nanoskopická věda,“ říká. „Biomolekuly jsou nanoskopické a interakce mezi biomolekuly probíhají na nanoskopických vzdálenostech. Mnoho nejdůležitějších problémů v biologii a medicíně zahrnuje nanoskopické otázky.“ Několik druhů sofistikovaných mikroskopů, z nichž každý má své vlastní výhody a nevýhody, může tento druh detailů odhalit. Tyto metody jsou však nákladné a vyžadují specializované dovednosti, díky čemuž jsou pro většinu výzkumníků nedostupné. „Expanzní mikroskopie demokratizuje nanozobrazování,“ říká Boyden. „Nyní se každý může podívat na stavební bloky života a na to, jak se vzájemně vztahují.“

Posilování vědců

Od doby, kdy Boydenův tým představil expanzní mikroskopii v roce 2015, výzkumné skupiny po celém světě publikovaly stovky článků, které informují o objevech, které učinily pomocí expanzní mikroskopie. Pro neurovědce tato technika osvětlila složitosti propracovaných nervových obvodů, odhalila, jak se určité proteiny organizují na a přes synapsích, aby usnadnily komunikaci mezi neurony, a odhalila změny spojené se stárnutím a nemocemi.

Stejně tak posílila i studie mimo mozek. Sabrina Absalonová používá expanzní mikroskopii každý týden ve své laboratoři na Lékařské fakultě Indiana University ke studiu malarického parazita, jednobuněčného organismu plného specializovaných struktur, které mu umožňují infikovat a žít uvnitř hostitelů. Parazit je tak malý, že většinu těchto struktur nelze vidět běžnou světelnou mikroskopií. „Jako buněčná bioložka tak přicházím o největší nástroj k odvození funkce proteinů, architektury organel, morfologie spojené s funkcí a všechny ty věci – což je moje oko,“ říká. S expanzí může nejen vidět organely uvnitř malarického parazita, ale může je sledovat, jak se skládají a co se s nimi děje, když se parazit dělí. Pochopení těchto procesů, říká, by mohlo pomoci vývojářům léků najít nové způsoby, jak zasáhnout do životního cyklu parazita.

Absalonová dodává, že přístupnost expanzní mikroskopie je obzvláště důležitá v oblasti parazitologie, kde probíhá mnoho výzkumů v částech světa, kde jsou omezené zdroje. Díky workshopům a výukovým programům v Africe, Jižní Americe a Asii se technologie dostává k vědcům, jejichž komunity jsou přímo postiženy malárií a dalšími parazity. „Nyní mohou získat superrozlišovací zobrazování bez velmi sofistikovaného vybavení,“ říká Absalonová.

Stále se zlepšuje

Od roku 2015 Boydenova interdisciplinární laboratorní skupina našla řadu kreativních způsobů, jak vylepšit expanzní mikroskopii a použít ji novými způsoby. Jejich standardní technika dnes umožňuje lepší značení, větší expanzní faktory a zobrazování s vyšším rozlišením. Buněčné rysy vzdálené méně než 20 nanometrů od sebe se nyní mohou dostatečně oddělit, aby se jevily zřetelně pod světelným mikroskopem.

Přizpůsobili také své protokoly tak, aby fungovaly s řadou důležitých typů vzorků, od celých hlístic (oblíbených u neurovědů, vývojových biologů a dalších výzkumníků) až po klinické vzorky. V této souvislosti ukázali, že expanze může pomoci odhalit jemné známky onemocnění, což by mohlo umožnit dřívější nebo méně nákladnou diagnostiku.

Původně skupina optimalizovala svůj protokol pro vizualizaci proteinů uvnitř buněk značením proteinů zájmu a jejich ukotvením k hydrogelu před expanzí. Pomocí nového způsobu zpracování vzorků mohou uživatelé nyní znovu barvit své rozšířené vzorky novými značkami pro více kol zobrazování, takže mohou přesně určit polohy desítek různých proteinů ve stejné tkáni. To znamená, že výzkumníci si mohou vizualizovat, jak jsou molekuly organizovány vůči sobě navzájem a jak by mohly interagovat, nebo prozkoumat velké soubory proteinů, aby zjistili například, co se mění s nemocí.

Ale lepší pohledy na proteiny byly jen začátkem expanzní mikroskopie. „Chceme vidět všechno,“ říká Boyden. „Rádi bychom viděli každou biomolekulu, která existuje, s přesností až na atomovou úroveň.“ Ještě tam nejsou – ale s novými sondami a upravenými postupy je nyní možné vidět nejen proteiny, ale také RNA a lipidy v expandovaných vzorcích tkání.

Značení lipidů, včetně těch, které tvoří membrány obklopující buňky, znamená, že výzkumníci nyní mohou vidět jasné obrysy buněk v expandovaných tkáních. S vylepšeným rozlišením poskytovaným expanzí lze dokonce tenké výběžky neuronů sledovat pomocí obrazu. Výzkumníci se typicky spoléhali na elektronovou mikroskopii, která generuje nádherně detailní obrázky, ale vyžaduje drahé vybavení, pro mapování mozkových obvodů. „Nyní můžete získat obrázky, které vypadají velmi podobně jako obrázky z elektronové mikroskopie, ale na běžných světelných mikroskopech – takových, ke kterým má každý přístup,“ říká Boyden.

Boyden říká, že expanze může být silná v kombinaci s dalšími špičkovými nástroji. Když se expandované vzorky použijí s ultrafastní zobrazovací metodou vyvinutou Ericem Betzingem, investigátorem HHMI na Kalifornské univerzitě v Berkeley, zvanou mikroskopie mřížkových světelných listů, lze celý mozek octomilky zobrazit s vysokým rozlišením během pouhých několika dnů.

A když jsou molekuly RNA ukotveny v síti hydrogelu a poté sekvenovány na místě, vědci mohou vidět přesně, kde uvnitř buněk jsou umístěny instrukce pro tvorbu specifických proteinů, což Boydenův tým demonstroval ve spolupráci s genetikem z Harvardovy univerzity Georgem Churchem a tehdejším profesorem MIT Aviv Regevovou. „Expanze v podstatě upgraduje rozlišení mnoha dalších technologií,“ říká Boyden. „Děláte zobrazování hmotnostní spektrometrií, rentgenové zobrazování nebo Ramanovo zobrazování? Expanze vám prostě vylepšila přístroj.“

Rozšiřující se možnosti

Deset let po první demonstraci síly expanzní mikroskopie se Boyden a jeho tým zavázali k dalšímu posilování expanzní mikroskopie. „Chceme ji optimalizovat pro různé druhy problémů a zrychlení, zlepšení a zlevnění technologií je vždy důležité,“ říká. Ale budoucnost expanzní mikroskopie bude poháněna inovátory i mimo Boydenovu laboratoř. „Expanze není jen snadná na provedení, ale také snadno modifikovatelná – takže mnoho dalších lidí ji zlepšuje ve spolupráci s námi, nebo dokonce samostatně,“ říká Boyden.

Boyden poukazuje na skupinu vedenou Silviem Rizzolim na Univerzitním lékařském centru Göttingen v Německu, která ve spolupráci s Boydenem přizpůsobila expanzní protokol k rozlišení fyzických tvarů proteinů. Na Korejském pokrokovém institutu vědy a techniky výzkumníci vedeni Jae-Byum Chang, bývalým postdokem v Boydenově skupině, zjistili, jak expandovat celá těla myších embryí a mladých zeber, a ve spolupráci s Boydenem připravili půdu pro zkoumání vývojových procesů a dálkových nervových spojení s novou úrovní detailů. A mapování spojení v hustých nervových obvodech mozku by se mohlo zjednodušit pomocí konnektomiky na bázi světelné mikroskopie, přístupu vyvinutého Johann Danzlem a jeho kolegy z Institutu vědy a techniky v Rakousku, který využívá jak vysoké rozlišení, tak i molekulární informace, které může expanzní mikroskopie odhalit.

„Krása expanze spočívá v tom, že umožňuje vidět biologický systém až do jeho nejmenších stavebních bloků,“ říká Boyden.

Jeho tým má v úmyslu posunout metodu na její fyzické limity a očekává nové příležitosti k objevování, jak tak činí. „Pokud můžete zmapovat mozek nebo jakýkoli biologický systém na úrovni jednotlivých molekul, můžete si uvědomit, jak všechny fungují společně jako síť – jak život skutečně funguje,“ říká.