Revoluční nástroj pro genovou terapii: Kompaktní enzym NovaIscB

Vědci z McGovern Institute for Brain Research na MIT a Broad Institute of MIT and Harvard úspěšně přepracovali kompaktní RNA-řízený enzym z bakterií, čímž vytvořili efektivní a programovatelný nástroj pro editaci lidské DNA.

Tento nově vytvořený protein, nazvaný NovaIscB, umožňuje přesné změny genetického kódu, modulaci aktivity specifických genů a další editační úkony. Díky své malé velikosti, která usnadňuje dodání do buněk, představuje NovaIscB slibného kandidáta pro vývoj genových terapií k léčbě a prevenci nemocí. Výzkum vedl Feng Zhang, profesor neurovědy na MIT a zároveň výzkumník v McGovern Institute a Howard Hughes Medical Institute, a hlavní člen Broad Institute. Výsledky studie byly publikovány v časopise Nature Biotechnology (odkaz na článek).

NovaIscB je odvozen z bakteriálního nástroje pro řezání DNA, patřícího do rodiny proteinů zvaných IscBs, které Zhangův tým objevil v roce 2021. IscBs jsou typem OMEGA systému, evolučních předchůdců Cas9, který je součástí bakteriálního CRISPR systému, který Zhang a další vědci rozvinuli do výkonných nástrojů pro editaci genomu. Podobně jako Cas9, enzymy IscB štěpí DNA na místech určených RNA průvodcem. Reprogramováním tohoto průvodce mohou vědci přesměrovat enzymy na cílové sekvence dle vlastního výběru.

IscBs zaujaly tým nejen kvůli sdíleným klíčovým vlastnostem s CRISPR systémem a Cas9, ale i kvůli třetinové velikosti oproti Cas9. To je velká výhoda pro potenciální genové terapie: kompaktní nástroje se snáze dodávají do buněk a s malým enzymem mají vědci větší flexibilitu pro úpravy, potenciálně přidávání nových funkcí bez vytváření příliš objemných nástrojů pro klinické použití.

Z počátečních studií IscBs vědci v Zhangově laboratoři věděli, že někteří členové této rodiny dokáží štěpit cílové DNA sekvence v lidských buňkách. Žádný z bakteriálních proteinů však nefungoval dostatečně dobře pro terapeutické nasazení: tým musel upravit IscB, aby zajistil efektivní editaci cílů v lidských buňkách bez narušení zbytku genomu.

Aby zahájili tento proces, Soumya Kannan a Shiyou Zhu (postdoktorand) nejprve hledali IscB, který by byl dobrým výchozím bodem. Testovali téměř 400 různých enzymů IscB, které se nacházejí v bakteriích. Deset z nich dokázalo editovat DNA v lidských buňkách. I ten nejúčinnější z nich však vyžadoval vylepšení, aby se stal užitečným nástrojem pro editaci genomu. Výzvou bylo zvýšit aktivitu enzymu, ale pouze na sekvencích určených RNA průvodcem. Pokud by se enzym stal aktivnějším, ale nerozlišujícím, štěpil by DNA na nezamýšlených místech. „Klíčem je vyvážit zlepšení aktivity a specifičnosti současně,“ vysvětluje Zhu.

Zhu poznamenává, že bakteriální IscBs jsou směrovány k cílovým sekvencím poměrně krátkými RNA průvodci, což ztěžuje omezení aktivity enzymu na specifickou část genomu. Pokud by bylo možné IscB upravit tak, aby pojal delší průvodce, bylo by méně pravděpodobné, že by působil na sekvence mimo zamýšlený cíl.

Pro optimalizaci IscB pro editaci lidského genomu tým využil poznatky o rozmanitosti bakteriálních IscBs a jejich evoluci. Vědci si například všimli, že IscBs, které fungovaly v lidských buňkách, obsahovaly segment, který nazvali REC, který chyběl u jiných IscBs. Podezřívali, že enzym tento segment potřebuje k interakci s DNA v lidských buňkách. Při bližším pohledu na oblast naznačovalo strukturní modelování, že mírným rozšířením části proteinu by REC mohl také umožnit IscBs rozpoznávat delší RNA průvodce.

Na základě těchto pozorování tým experimentoval s výměnou částí REC domén z různých IscBs a Cas9, hodnotil, jak každá změna ovlivnila funkci proteinu. Vědci provedli další změny, s cílem optimalizovat jak efektivitu, tak specifičnost. Nakonec vytvořili protein, který nazvali NovaIscB, který byl v lidských buňkách více než 100krát aktivnější než výchozí IscB a vykazoval dobrou specifičnost pro své cíle.

Kannan a Zhu zkonstruovali a prozkoumali stovky nových IscBs, než dospěli k NovaIscB – a každá změna, kterou provedli na původním proteinu, byla strategická. Jejich úsilí bylo vedeno znalostmi přirozené evoluce IscBs, jakož i předpověďmi, jak každá úprava ovlivní strukturu proteinu, provedenými pomocí nástroje umělé inteligence AlphaFold2. Ve srovnání s tradičními metodami zavádění náhodných změn do proteinu a promítání jejich účinků tento přístup racionálního inženýrství výrazně urychlil schopnost týmu identifikovat protein s požadovanými vlastnostmi.

Tým prokázal, že NovaIscB je dobrým základem pro řadu nástrojů pro editaci genomu. „Biochemicky funguje velmi podobně jako Cas9, což usnadňuje přenos nástrojů, které byly již optimalizovány s lešením Cas9,“ říká Kannan. S různými úpravami vědci použili NovaIscB k nahrazení specifických písmen DNA kódu v lidských buňkách a ke změně aktivity cílených genů.

Je důležité, že nástroje založené na NovaIscB jsou dostatečně kompaktní, aby se snadno vešly do jednoho adeno-asociovaného viru (AAV) – vektoru nejčastěji používaného k bezpečnému dodávání genové terapie pacientům. Protože jsou objemnější, nástroje vyvinuté pomocí Cas9 mohou vyžadovat složitější strategii dodání.

Pro demonstraci potenciálu NovaIscB pro terapeutické použití vytvořil Zhangův tým nástroj nazvaný OMEGAoff, který přidává chemické značky do DNA, aby snížil aktivitu specifických genů. Naprogramovali OMEGAoff k potlačení genu podílejícího se na regulaci cholesterolu a poté použili AAV k dodání systému do jater myší, což vedlo k trvalému snížení hladiny cholesterolu v krvi zvířat.

Tým očekává, že NovaIscB bude možné použít k cílení nástrojů pro editaci genomu na většinu lidských genů a těší se, jak jiné laboratoře novou technologii nasadí. Doufají také, že ostatní přijmou jejich evolučně řízený přístup k racionálnímu inženýrství proteinů. „Příroda má takovou rozmanitost a její systémy mají různé výhody a nevýhody,“ říká Zhu. „Učením se z této přirozené rozmanitosti můžeme systémy, které se snažíme navrhovat, stále vylepšovat.“

Tato studie byla částečně financována K. Lisa Yang a Hock E. Tan Center for Molecular Therapeutics na MIT, Broad Institute Programmable Therapeutics Gift Donors, Pershing Square Foundation, Williamem Ackmanem, Neri Oxman, rodinou Phillips a J. a P. Poitras.